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挥发性脂肪酸的测定(一)气相色谱测定法

发布时间:2019-10-28 11:35人气:

挥发性脂肪酸的测定
 
一般来说,碳原子数在10以下的脂肪酸大部分具有挥发性,并且易溶于水。在它们中间,随着碳原子数的增加,挥发性逐渐下降。典型的挥发酸见附表5。
附表5 低级脂肪酸的分子式及沸点

名称 分子式 沸点/℃ 名称 分子式 沸点/℃
甲酸
乙酸
丙酸
HCOOH
CH3COOH
C2H5COOH
100.8
117.5
140.0
丁酸
戊酸
已酸
C3H7COOH
C4H9COOH
C5H11COOH
162.3
185.5
205.0
挥发性脂肪酸易被微生物利用。在有机物的厌氧分解中,挥发性脂肪酸是作为生物代谢的中间或最终产物而存在。在厌氧发酵的液化产酸阶段,这一类低级脂肪酸是这一阶段的主要产物,其中以乙酸为主。在某种条件下,乙酸可以达到该类酸总量的80%。在CH4形成过程中,甲酸和乙酸是形成甲烷的重要前体物。据研究,自然界有机物产生的CH4中大约有70%上由乙酸中的甲基原子团形成的。丙酸、丁酸可以转化成甲酸。有机酸过多往往反映出发酵池的病态。因此可以认为,在微生物厌氧发酵过程中,挥发性脂肪酸不仅是一种不可缺少的营养成分,更重要的意义在于这类有机酸已是沼气发酵研究有机物降解工艺条件优劣的重要参数,在甲烷形成的研究和生产中,它们的含量也是重要的参数。
在挥发性脂肪酸的总量测定中,是以乙酸作为基数进行计算,除了要求测定总量外,对甲酸、乙酸等各种低级脂肪酸的分别定量分析也是十分重要的。

 C2~C5挥发性脂肪酸的气相色谱测定法

2.5.1.1  测定原理
使用色谱仪上的氢火焰检测器测定挥发性脂肪酸含量,其基本原理是:色谱柱分离后馏出的物质被载气载入检测器离子室的喷嘴口,与燃烧气—氢气相混合,并以空气助燃气进行燃烧,以此为能源,将组分电离成离子数目相等的正离子和负离子(电子)。在离子室内装有收集极和底电极,因此离子在电场内作定向流动,形成离子流。该离子流被收集极收集后,经过微电流放大器放大输送给记录仪得到信号,此信号的大小代表单位时间内进入检测器火焰的组分含量。


1、测定条件

⑴试剂设备
① 乙酸、丙酸、丁酸、戊酸混合标准液的配制。分别吸取乙酸(A.R.,相对密度1.045,含量99%)、丙酸(A.R.,相对密度0.9987,含量99.5%)、丁酸(A.R.,相对密度0.8097,含量99%)、戊酸(A.R.,相对密度0.934,含量100%)各25μL于50mL容量瓶中,再加入2.5mL甲酸(A.R.,相对密度1.22,含量88%),最后用蒸馏水定容。其中乙酸、丁酸、戊酸的浓度分别为517μL/L、497μL/L、401μL/L、467μL/L。
② 6mol/ L硫酸的配制:将167mL浓硫酸(相对密度1.84)缓慢倒入833mL蒸馏水中。
③ 甲酸:相对密度1.22,含量88%。
④ 离心机4000~16000r/min。
⑤ 气相色谱仪,FID检测器。
⑵ 样品预处理  用沼气发酵液7mL加入2滴6mol/ L H2SO4使pH值降至3.5左右(用pH试纸粗测),离心20~30 min,取上层透明清液3mL,加入0.15 mL浓甲酸,最终pH值为2.0左右(控制在3.0以下)。
⑶ 主要实验参数
① 条件一。固定相:GDX103+H3PO4,2%(60~80目);色谱柱:2m×φ6mm;柱温:180~200℃;气化室温度:240℃;检测温度:210℃;进样量:2μL;载气流量:N2,50mL/ min;氢气流量:50 mL/ min;空气流量:600~700 mL/ min;衰减:×1/8。
② 条件二。色谱柱:2m×φ3mm,不锈钢柱,内填国产GDX-401担体,60~80目;柱温:210℃;载气:N2,流率为90mL/ min;空气流率:500 mL/ min;氢气流率:50 mL/ min;气化室温度:240℃;检测温度:210℃。
③ 条件三。色谱柱:2m×φ6mm,装有以2%磷酸饱和的60~80目GDX-103担体;柱温:180~200℃;气化室温度:240℃;检测温度:210℃;进样量:2μL;载气流量:N2,50mL/ min;氢气流量:50 mL/ min;空气流量:600~700 mL/ min;
④ 条件四。色谱柱:2m×φ2mm,玻璃柱,内装有10%的商品固定液FluoradFC431涂布的Supelcoport担体,100~200目;柱温:130℃;气化室温度:220℃;检测温度:210℃;载气流量:N2,40mL/ min。
⑷ 定性与定量
① 定性。配制模拟标准样品,用已知物质的保留时间对照被测物质的保留时间进行定性。
② 定量。用已知样校正法进行定量,其方法是配制已知浓度的标准样(与样品组分一致),进行色谱试验,测量标准样各组分的峰高(或峰面积),求出组分i的单位峰高(或峰面积)的组分含量或作出峰高和浓度的标准曲线。当样品组分浓度变化不大时,可采用单位校正法。当样品组分浓度变化很大时,则需预先用校准样作出浓度和峰高或峰面积的标准曲线,观察其标准曲线是不是通过原点的直线,即是否呈线性。若呈线性,就可用单点校正法,按下面的公式计算:

 挥发性脂肪酸的测定公式
2、方法的精度和注意事项:
 
⑴ 以GDX103+H3PO42%为固定相,比用GDX101 、PEGS、Porapak.N等作为固定相其保留时间短,且峰形对称。
⑵ 本法最小检测量为4μL/L,相对误差为1.8%,相对标准偏差〈2.7%(以乙酸计)。
⑶ 有机酸是一种强极性物质,沸点较高,由于担体对酸的吸附,常常引起酸峰拖尾和鬼峰的出现。因此,取有机酸直接进样测定时,为了抑制酸的吸附,可采取以下措施。
① 在样品中加入一定量的浓甲酸(相对密度1.22,含量88%),使其甲酸加入量(体积)与样品的体积比为5:100。甲酸是一种一元羧酸,离解常数(2.11×10-4)大于其他任何一元羧酸,当含有甲酸的样品进入固定相时,担体表面的吸附中心位置被甲酸暂时占据,这样便抑制了C2~C5酸被担体的吸附。此外,甲酸在FID上响应很低,故对其他组分的应答影响不大。
② 酸的吸附还发生在接近进样口的地方,由于进样口常积累有碳质沉积物,通常采用蒸馏水清洗进样口,并用1.5%磷酸-丙酮液来浸泡进样口,然后在约150℃的温度下将进样口烘烤4~8h。
③ 用1.5%磷酸-丙酮液来浸泡柱口玻璃毛。
④ 在分析高浓度时,一定分析周期内注射水或15%甲酸液来洗涤被柱子吸附的酸。
⑤ 操作条件恒定以后,在进标准酸样或样品之前,用15%的甲酸液来冲洗柱子3~4次。
⑷ 柱子使用寿命大约4~6个月,一旦发现色谱峰出现拖尾或重复性差,则必须更换柱。
⑸ 尽管采取了一系列防止吸附的措施,但柱子的吸附问题还是不可能完全解决,特别是对于4000μL/L以上高浓度的酸样,如何克服吸附问题还值得更进一步研究。
⑹ 当检测器的灵敏度显著降低或更换新柱之后,重新做校正曲线。


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